LEUCEMIA FELINA: ESTUDIO SEROEPIDEMIOLÓGICO. DIAGNÓSTICO POR PCR DE 230 CASOS

Álvaro Arjona Saz 
Veterinario Clínico.
y Esperanza Gómez Lucía
Profesora titular del Dpto. de Patología Animal I . Facultad de Veterinaria (UCM).

INTRODUCCIÓN

El virus de la leucemia felina (FeLV), un retrovirus de la subfamilia Oncovirinae, fue aislado por primera vez en Escocia de un gato que había desarrollado linfosarcoma (Jarrett et al.,1964). Estudios posteriores revelaron que FeLV era un oncoretrovirus exógeno que se transmitía de manera contagiosa entre gatos, diferenciándose así del grupo de retrovirus endógenos, que se transmiten verticalmente. Los oncoretrovirus endógenos son secuencias de DNA integradas en el genoma de células germinales y somáticas de todos los gatos, que no se replican ni producen enfermedad alguna (Todaro, 1980). Recientemente se ha reestructurado la subfamilia Oncovirinae, incluyendo a FeLV en el género Gammaretrovirus (Murphy, 1999). 

Se han identificado tres subgrupos de FeLV: A, B, y C. FeLV-A está presente en todos los gatos infectados, sólo o en combinación con B y/o C. FeLV-B se piensa que surge de la recombinación entre FeLV-A y secuencias endógenas (Bechtel et al., 1998), y se relaciona con el desarrollo de linfosarcoma. FeLV-C se aísla raramente (menos de un 1% de los gatos infectados), y surge por mutaciones de los otros dos subgrupos (Jarrett, 1992). La infección experimental de FeLV-C en gatitos induce anemia aplásica (Mathes et al., 1994). Los subgrupos B y C son parcial o totalmente defectuosos en su replicación, por lo que necesitan la presencia de FeLV-A para que exista infección productiva. 

El virus de la leucemia felina sigue el ciclo típico de replicación de los retrovirus. Tras la unión de la glicoproteína gp70 con el receptor celular específico, se produce la penetración del core y el RNA viral es liberado al citoplasma. Por acción de la transcriptasa inversa, se obtiene una copia de DNA de doble cadena que penetra en el núcleo celular y se integra en el genoma de la célula infectada. El DNA integrado (provirus) sirve como molde para la producción de RNAm, el cual es traducido en proteínas o RNA viral, que se encapsida en los viriones. La liberación de las partículas víricas se produce por gemación. 

EPIDEMIOLOGÍA. El virus de la leucemia felina infecta a gatos domésticos en todo el mundo, y, ocasionalmente, a félidos salvajes (Barlough & Scott, 1993). Se han realizado estudios epidemiológicos en varios países utilizando diversos métodos inmunológicos que detectan antígenos de FeLV. En Europa, la prevalencia de animales sanos infectados por FeLV oscila entre un 1-5%, mientras que en animales enfermos la prevalencia alcanza valores de un 13-18% (Boller & von Steiger, 1987; Hosie et al., 1989; Glennon et al., 1991; Hayes et al., 1992; Sukura et al., 1992; Ueland & Lutz, 1992; Carmichael & Broadley, 1994; Mainland, 1994). De los resultados de estos estudios se concluye que los gatos enfermos presentan tres veces mayor probabilidad que los asintomáticos a ser FeLV positivos. Las prevalencias más altas se encuentran en colonias de gatos donde el virus es enzoótico. La cantidad de machos positivos suele ser casi el doble que la de hembras, y la media de edad de los animales positivos se establece en tres años. 
La excreción de virus en los gatos con viremia persistente se realiza a través de la saliva, orina, lágrimas y leche, siendo la ruta más común de infección el acicalamiento entre individuos, o compartir las mismas fuentes de agua y alimento. Es necesario un contacto estrecho y prolongado para que se produzca el contagio del virus. La transmisión por fómites y aerosoles es poco probable ya que el virus resiste muy poco en el ambiente. La infección por el virus de la leucemia felina en gatas gestantes produce muerte fetal y neonatal en el ochenta por ciento de los casos, si bien la transmisión transplacentaria y transmamaria es poco frecuente en los gatitos supervivientes de madres infectadas (Pedersen, 1988).

PATOGENIA Y SIGNOS CLÍNICOS. Tras la exposición a FeLV, existen distintas posibles evoluciones que son: infección aguda, viremia persistente, infección latente, e infecciones atípicas. (Rojko & Olsen, 1984; Hoover & Mullins, 1991; Rojko & Kociba, 1991; Rojko & Hardy, 1994). La evolución en cada gato depende del tipo de virus, la duración de la exposición, la edad del animal, y de la respuesta inmune del gato. En la mayoría de los gatos, la infección aguda se debe a una exposición oronasal, con una replicación viral inicial en linfocitos y macrófagos de las tonsilas y otros tejidos linfoides regionales. Aproximadamente a las dos semanas de la exposición se establece una viremia asociada a linfocitos y macrófagos, lo que permite la diseminación del virus a otros tejidos linfoides lejanos, al epitelio intestinal y a la médula ósea. 

La infección de la médula ósea generalmente se establece entre las dos y seis semanas tras la exposición al virus. Si durante la infección de la médula ósea falla el sistema inmune, provocará una replicación masiva de virus y el desarrollo de viremia persistente, en la que el virus está en la sangre tanto libre como asociado a células, diseminándose a múltiples tejidos epiteliales y glandulares, favoreciendo así el contagio a otros gatos. El pronóstico de los gatos persistentemente virémicos es malo, ya que tras un periodo asintomático, la mayoría muere en dos o tres años por una enfermedad relacionada con FeLV. Una respuesta inmune competente entre las cuatro y ocho semanas tras la exposición, restringe la multiplicación y la expresión del virus. Muchos de los gatos desarrollan la inmunidad a FeLV antes o durante la infección de la médula ósea, no desarrollando viremia persistente. Una pequeña proporción de gatos no desarrolla esta inmunidad hasta que la viremia tras la infección de la médula ósea se ha establecido, por lo que sufren una viremia transitoria durante días o algunas semanas (Rojko & Hardy, 1994).
Los gatos inmunes que restringen la multiplicación y expresión viral, pueden padecer una infección latente si el provirus está integrado en las células precursoras de la médula ósea y en linfocitos circulantes. En estos casos, FeLV no se expresa, pero si el animal sufre alguna depresión del sistema inmune (estrés, corticoides), se puede reactivar la infección (Rojko 1982; Rojko & Olsen, 1984). El periodo de latencia puede durar meses, años, e incluso toda la vida del animal, pudiéndose revertir en una infección productiva (Rojko & Hardy, 1994).

Las infecciones atípicas afectan a menos de un diez por ciento de los gatos infectados, y se caracterizan por ser infecciones secuestradas en diversas localizaciones (tejidos epiteliales, glandulares, médula ósea) por una respuesta inmune parcialmente eficaz. Estos animales pueden sufrir periodos alternantes de viremia y en algunos casos progresar a viremia persistente (Rojko & Hardy, 1994). 

El desarrollo de sintomatología asociada a la infección por el virus de la leucemia felina depende en gran medida de la edad del gato afectado. En la mayoría de los gatos no aparecen manifestaciones clínicas tras meses o años de infección, si bien los gatitos jóvenes suelen enfermar durante la fase aguda (Hoover & Mullins, 1991). Las enfermedades inducidas por FeLV se pueden dividir en dos grupos: enfermedades no neoplásicas o degenerativas, y enfermedades neoplásicas. Las enfermedades no neoplásicas son resultado de la inmunosupresión, o bien son debidas a inmunocomplejos. Algunos autores () han apuntado a la posibilidad de que las infecciones por retrovirus felinos sean causa de lesiones renales. Dentro de las enfermedades neoplásicas, el linfoma (linfosarcoma), es la que tradicionalmente se asocia a FeLV. Menos frecuente que los tumores sólidos es el desarrollo de diversos tipos de leucemia. La leucemia linfoblástica es la más común y puede estar asociada o no al linfoma multicéntrico. También pueden aparecer otras leucemias no linfoides como eritroleucemia, leucemia mielógena, y otras alteraciones mieloproliferativas. Existen además otros síndromes relacionados con la infección por el virus de la leucemia felina tales como trastornos reproductivos, digestivos, lesiones oculares, y alteraciones neurológicas.

DIAGNÓSTICO. Para el diagnóstico de FeLV, no es suficiente la evidencia clínica de sus síndromes asociados, ya que, al ser signos inespecíficos y no exclusivos de la acción patógena del virus, es necesario realizar un diagnóstico laboratorial que confirme la infección.
Los métodos laboratoriales que se pueden utilizar para el diagnóstico de la infección por FeLV se dividen en métodos serológicos y métodos virológicos. Los métodos serológicos o indirectos que se emplean rutinariamente detectan el antígeno viral p27 (proteína de la cápside). Dentro de este grupo se han desarrollado fundamentalmente dos técnicas:

o INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA (IFD): La muestra (frotis de sangre entera o capa flogística), se examina usando anticuerpos monoclonales anti-p27 marcados con fluoresceína, permitiendo la detección del antígeno p27 en células infectadas (linfocitos o plaquetas). 

o ELISA (Enzyme-lynked immunosorbent assay): Existen kits comerciales que se utilizan en clínicas y laboratorios veterinarios. Por medio de anticuerpos monoclonales anti-p27, se produce la activación enzimática de un sustrato cromógeno en el caso de que en la muestra (sangre entera, plasma, suero, saliva o lágrimas) exista el antígeno p27.

La detección del antígeno p27 por cualquiera de las dos técnicas anteriores confirma que el gato está infectado por FeLV. Un resultado positivo para la técnica de IFD indica viremia asociada a células e infección productiva de la médula ósea (Hardy & Zuckermann, 1991), manteniendo de por vida la infección y la viremia el 97% de los gatos positivos. La técnica ELISA detecta el antígeno soluble p27, por lo que resulta más sensible y precoz en la detección de viremia e infecciones leves, pero no aporta información sobre si la viremia es transitoria o persistente. Para identificar los gatos virémicos persistentes, un ELISA positivo debe repetirse a los tres meses (volverá a dar un resultado positivo), o bien debe confirmarse con una IFD. Si el resultado es discordante (ELISA positivo, IFD negativo), quiere decir que el virus aún no ha alcanzado la médula ósea. Esta discordancia desaparecerá en un plazo de unos tres meses, cuando exista ya una viremia asociada a células infectadas liberadas de la médula ósea. Los casos de discordancia persistente se deben a infecciones localizadas en tejidos linfoides, glándulas salivales, u otros tejidos. Estos gatos se consideran avirémicos e incapaces de excretar virus infecciosos (Macy, 1989), sin embargo, existe cierto riesgo de que la infección alcance la médula ósea y entonces los gatos se conviertan en transmisores de virus infecciosos (Jarrett et al, 1991). 
Si bien estos métodos son sencillos, rápidos, y sensibles, dada la particular patogenia del virus, presentan limitaciones diagnósticas importantes que afectan al tratamiento y control de la enfermedad. Por ejemplo, para la técnica ELISA, existe un lapso de tiempo de unas dos semanas entre el momento de la infección y el desarrollo de viremia, en el que no se detectaría la infección. En el caso de la técnica IFD, hasta que no se produce infección productiva de la médula ósea (entre dos y doce semanas), tampoco es posible diagnosticar la infección. Cuando para la técnica ELISA se utilizan como muestra saliva o lágrimas, los resultados son irregulares, llegando al treinta por ciento de falsos negativos en gatos virémicos (Swango, 1991). Otro inconveniente es que es necesario repetir las pruebas a los gatos positivos con el fin de determinar si la viremia detectada es transitoria o persistente, y, en el caso de que el gato se retorne avirémico, no es posible detectar el estado de latencia si se ha integrado el virus en el genoma celular. 

Por otra parte, tenemos los métodos virológicos o también llamados directos, que se basan en la propia detección del virus o de su genoma (cuando está en forma de provirus). Dentro de estos métodos, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), ofrece cada día más posibilidades en el diagnóstico de agentes infecciosos. En el caso de FeLV, la PCR persigue la amplificación de DNA proviral integrado en las células infectadas. Los oligonucleótidos o "primers" específicos hibridan con sus secuencias complementarias, y por medio de sucesivos ciclos de desnaturalización, hibridación, y extensión, se consigue un gran número de copias del DNA diana, permitiendo su detección. Esta técnica ha sido ampliamente utilizada en estudios experimentales de FeLV, detectando la infección tanto en linfocitos de sangre periférica (Jackson et al., 1996; Miyazawa & Jarrett, 1997), como en tejidos frescos y formolizados (Ellis et al., 1996; Uthman et al., 1996). 

La detección de DNA proviral en linfocitos de sangre periférica permite el diagnóstico de infección por el virus de la leucemia felina independientemente de la existencia o no de viremia. Por ello, esta técnica resulta especialmente útil en el caso de infección latente en médula ósea y linfocitos, donde no existe replicación vírica, o bien en casos donde existe en muy poca cantidad (Innis 1990). Por otro lado, la única forma de saber si un gato que ha sufrido viremia transitoria es un portador latente, es realizar una técnica que detecte el DNA proviral, como es el caso de la PCR. En el caso de los animales discordantes persistentes, en los que no existe infección de la médula ósea, la PCR permite la detección del provirus integrado en las células de los tejidos en los que existe secuestro viral. Como inconveniente, hay que señalar que la PCR es una técnica más laboriosa en comparación con los métodos serológicos.

PREVENCIÓN. Evitar que los gatos tengan acceso a entornos de riesgo, o que entren en contacto con animales no controlados sanitariamente es fundamental. Los fómites potenciales como los comederos y las bandejas, nunca tendrían que ser compartidos entre animales infectados y no infectados. En este sentido, es imprescindible realizar pruebas diagnósticas a los animales recién adquiridos o adoptados. La vacunación contra el virus de la leucemia felina es un tema controvertido, ya que estudios experimentales han demostrado que ninguno de los cinco tipos de vacuna que existen en los mercados americano y europeo es eficaz al cien por cien (Sparkes, 1997). Se ha documentado el posible desarrollo de fibrosarcoma en el punto de inoculación, particularmente con el empleo de vacunas con adyuvante (Kass et al., 1993). No obstante, la vacunación siempre se debería considerar en gatos no infectados pero con riesgo de exposición a FeLV.

OBJETIVOS

Los objetivos de este trabajo fueron, en primer lugar, la realización de un estudio seroepidemiológico del virus de la leucemia felina en los gatos domésticos de Madrid, determinando la prevalencia de gatos infectados, tanto sanos como con sintomatología asociada a esta infección, datos que hasta ahora se desconocían. Dentro de este estudio, se analizaron diversos parámetros epidemiológicos como la edad, el sexo, y la procedencia de los gatos infectados por FeLV. También se estudiaron las alteraciones hematológicas y renales de los gatos infectados. Por último, se evaluó el comportamiento de una PCR anidada para el diagnóstico de FeLV, realizando un análisis comparativo con los resultados de un ELISA comercial, valorando las ventajas que ofrece la PCR frente al diagnóstico rutinario.


MATERIALES Y MÉTODOS

ORIGEN Y OBTENCIÓN DE MUESTRAS

Las muestras fueron obtenidas de gatos que acudían a la consulta de diversas clínicas veterinarias de Madrid, así como del Hospital Clínico Veterinario de la Facultad de Veterinaria de Madrid, y de muestras remitidas por el laboratorio veterinario privado LAV (Laboratorio de Análisis Veterinarios, Madrid). El proceso de recogida de muestras se inició en enero de 1.999 y terminó en noviembre del mismo año. Se obtuvo un total de 295 casos que fueron divididos en dos grupos: 

o GRUPO S (SANOS): 180 gatos que no presentaban ningún síntoma indicativo de infección por FeLV. Son gatos sanos que acudían a la consulta por motivos de control médico, vacunación, etc. 

o GRUPO E (ENFERMOS): 115 gatos que presentaban síntomas como anorexia, depresión, fiebre, linfadenomegalia, o procesos de estomatitis, rinotraqueítis, infecciones cutáneas, masas tumorales, etc., sugerentes de infección FeLV.

Se formó un subgrupo de gatos 35 "callejeros", pertenecientes indistintamente al grupo S o E. Estos eran animales recogidos de la calle, o bien tenían libre acceso al exterior. 
De todos los gatos de ambos grupos se obtuvo una muestra de sangre, utilizando como anticoagulantes EDTA o heparina, para la posterior realización de las dos técnicas diagnósticas. Todas las muestras (295), fueron analizadas por el método serológico (ELISA), mientras que el método virológico (PCR), se realizó en 230 casos. 

DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO (ELISA)

Se utilizó el kit comercial Snap Combo Plus® de Laboratorios Idexx, Inc., para la detección conjunta del antígeno p27 del virus de la leucemia felina, y del anticuerpo anti-gp40 del virus de la inmunodeficiencia felina. Para la realización del test se utilizó el plasma obtenido por centrifugación a 10.000 rpm durante cinco minutos.

DIAGNÓSTICO VIROLÓGICO (PCR ANIDADA)

Se utilizó la PCR anidada para la detección conjunta de FeLV y secuencias endógenas diseñada en el Departamento de Patología Animal I de la Facultad de Veterinaria (UCM). Una PCR anidada, gracias a sus dos etapas de amplificación, aumenta la sensibilidad y especificidad en la detección de DNA proviral. Sus resultados con células de cultivos infectados han sido plenamente satisfactorios, si bien es necesaria su evaluación en el diagnóstico rutinario. En el diseño de esta PCR se ha incluido un control interno de reacción; además de la detección de FeLV, las secuencias endógenas (presentes en el genoma de todos los gatos) también son amplificadas, por lo que se minimiza el riesgo de falsos negativos. 

Los linfocitos obtenidos de cada muestra de sangre fueron sometidos a una extracción fenólica de DNA, a partir del cual se realizó la PCR. Como objetivos de amplificación, se escogieron secuencias de la región pol como por ser un gen muy conservado en los retrovirus (Tabla 1). Al tratarse de una PCR anidada, cada amplificación está formada por dos reacciones sucesivas, siendo el producto de la primera el sustrato de partida de la segunda reacción. La primera reacción de PCR persigue la amplificación de secuencias homólogas de FeLV y endógenos. Para esta primera PCR se empleó la pareja de oligonucleótidos FF1 y FF2. Estos primers producen la amplificación de un fragmento de 491 pares de bases para FeLV y para las secuencias endógenas. La segunda reacción de PCR utiliza como molde los productos amplificados en la primera reacción para la detección diferencial de FeLV y endógenos. Para ello se utilizó la parejas de oligonucleótidos: FE7 / FE4, que amplifican un fragmento de 305 pb para FeLV, y 257 pb para endógenos. Al obtener productos de amplificación de diferente tamaño, se pueden distinguir FeLV y las secuencias endógenas. El análisis de los productos de PCR se realizó mediante electroforesis en geles de agarosa bromurizados. Los geles se visualizaron bajo luz UV en un transiluminador.

Para confirmar que los productos de amplificación correspondían efectivamente a las secuencias retrovirales, se realizó la purificación de DNA con los kits GENECLEAN y QIAquick Spin. El DNA purificado fue secuenciado en el Laboratorio de Secuenciación de la Facultad de Farmacia (UCM). Los resultados obtenidos se analizaron con el software BLAST 2.0.10 junto con la base de datos GeneBank, y confirmaron que los productos amplificados se identificaban con las secuencias objetivo.

ANÁLISIS CLÍNICOS

HEMATOLOGÍA: se analizó el número de hematíes, leucocitos, y la fórmula leucocitaria. Se realizaron 27 analíticas de gatos FeLV positivos, y como control, 43 analíticas de gatos negativos. Los intervalos fisiológicos considerados fueron: 5.5-10 millones de hematíes/ml, 5.5-19.5 miles de leucocitos/ml, 35-75% de neutrófilos y 20-55% de linfocitos. Los datos hematológicos son cortesía del Laboratorio de Análisis Veterinarios (LAV), habiendo sido realizados en un contador celular Technicon H1 (Bayer). 

PERFIL RENAL: se analizaron los valores de urea y creatinina en sangre de 213 muestras (de los 295 casos en total), estableciendo unos intervalos fisiológicos de 20-50 mg/dl para la urea y 1-2 mg/dl para la creatinina. Los análisis fueron realizados por el Laboratorio de Biopatología Clínica del Hospital Clínico Veterinario de la Facultad de Veterinaria de Madrid.

MÉTODOS ESTADÍSTICOS

PRUEBA DE ASOCIACIÓN: se utilizó el test c2 para el cálculo del valor p, con un valor a de 0.05.

TEST DE CONCORDANCIA ENTRE PRUEBAS DIAGNÓSTICAS: se calculó el valor k con un nivel de confianza del 95%.

ALMACENAMIENTO Y PROCESAMIENTO DE DATOS: se han utilizado los programas informáticos WinEpiscope 2.0, SPSS 9.0, y Microsoft Access 8.0.


RESULTADOS

RESULTADOS SEROEPIDEMIOLÓGICOS (ELISA)

SEROPREVALENCIA DE FeLV: En el grupo S (180 gatos sanos), se detectó el antígeno p27 del virus de la leucemia felina en el plasma de 31 gatos (17.7%). De los 115 animales enfermos (grupo E), 39 gatos resultaron ser positivos a FeLV (33.9%). De los 35 animales "callejeros" (tanto sanos como enfermos), 12 gatos (34.3%) resultaron FeLV positivos (Figura 1).

EDAD DE LOS ANIMALES INFECTADOS: Para el estudio de la edad, se dividieron los casos en tres estratos: gatos menores de 3 años (jóvenes), gatos de 3 a 8 años (adultos), y gatos mayores de 8 años (viejos). En el grupo S, el 70% de los casos positivos a FeLV tenía menos de 3 años, el 20% tenía entre tres y ocho años y el 10%, más de 8 años. La distribución de edades en el grupo E, difirió de la del grupo de animales sanos: de los gatos FeLV positivos, el 50.1% eran jóvenes, el 42.8% eran adultos, y el 7.1% de eran animales viejos (Figura 2).

SEXO DE LOS ANIMALES INFECTADOS: En cuanto a la distribución por sexos, en el grupo de animales sanos, la proporción de machos positivos a FeLV es significativamente mayor que la de hembras. De 103 animales del grupo S de los que conocíamos el sexo, el 63.2% de los gatos positivos a FeLV eran machos. Sin embargo, de 94 casos del grupo E (enfermos), la proporción de machos positivos a FeLV se reducía al 41.4% (Figura 3). Estos datos parecen indicar que el sexo puede influir de alguna manera en el desarrollo de síntomas relacionados con las infecciones por FeLV o FIV.

ANÁLISIS CLÍNICOS

HEMOGRAMA: de los 79 gatos analizados, un 50% de los gatos positivos a FeLV, tenía anemia. La proporción de gatos anémicos del grupo control (FeLV negativo) era de un 14%. La infección por FeLV parecen estar relacionada con estados anémicos, existiendo una asociación estadísticamente significativa (P<0.05). 

El 46.2% de los casos positivos al virus de la leucemia felina presentaba leucopenia, mientras que el 30.8% presentaba leucocitosis. Existe una asociación estadísticamente significativa entre la leucopenia y la infección por FeLV (P<0.05). 

FÓRMULA LEUCOCITARIA: no se obtuvieron resultados significativos. La alteración más frecuentes de los gatos infectados fue neutropenia (33.3%).
UREA Y CREATININA: presentaron valores altos de urea el 45.8% de los gatos FeLV positivos. La proporción de gatos negativos (grupo control) que tuvieron valores altos de urea fue del 51%. El 9.1% de los animales positivos a FeLV dieron valores altos de creatinina. La proporción de gatos negativos (grupo control) con niveles altos de creatinina en sangre fue de un 13.2%. 

DIAGNóSTICO POR PCR

CONTROL E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS: La PCR es una técnica en la que las posibles contaminaciones por DNA amplificado exigen el diseño de diversos controles de reacción (tanto positivos como negativos), así como una cuidadosa interpretación de los resultados. En este caso, además del los control positivos de FeLV, y del control negativo de contaminaciones (tubo sin DNA con agua ultrapura estéril), se utilizó como control interno de reacción la detección de DNA amplificado de secuencias endógenas. Como estas secuencias se encuentran en el DNA de todos lo gatos, la no-aparición de la banda correspondiente junto con la ausencia de detección de FeLV, supone que la reacción de la polimerasa no ha funcionado, o bien que no existía DNA en la muestra problema (DNAsas, fallos en la extracción...), reduciéndose así el riesgo de falsos negativos. Con el fin de obtener la máxima fiabilidad en los resultados, los casos de interpretación dudosa y los casos discordantes con los resultados ELISA, fueron repetidos. De las 230 muestras iniciales de DNA a las que se les realizó la PCR, 51 no presentaron amplificación alguna (posibles falsos negativos), por lo que los resultados que se exponen a continuación se refieren a las 179 muestras restantes.
RESULTADOS PCR: Del total de 179 muestras procesadas, 151 pertenecían al grupo S (gatos sanos), y 28 al grupo E (gatos enfermos). En el grupo de animales sanos, 54 (35.8%) resultaron FeLV positivos. En el grupo de animales enfermos, 10 (35.7%) resultaron FeLV positivos. Se realizó la PCR en 25 muestras del subgrupo de gatos callejeros, y 13 gatos (52%) resultaron FeLV positivos.

COMPARACIÓN CON LOS RESULTADOS OBTENIDOS POR ELISA: En la Figura 1, se comparan las prevalencias de gatos FeLV positivo obtenidas por las dos técnicas (ELISA y PCR), en los grupos de animales sanos y enfermos.

Se detectó genoma proviral de FeLV en 64 muestras, de las que 16 (25%), eran ELISA negativo. De los 115 animales restantes en los que no se detectó amplificación de FeLV, 6 (5.2%) eran ELISA positivo (Tabla 2).

Por el propio diseño de PCR, se dieron dos tipos de detección de FeLV. Bien aparecía exclusivamente una banda muy intensa a la altura de FeLV, o bien aparecían dos bandas correspondientes a FeLV y a secuencias endógenas. De las 64 muestras positivas a FeLV por PCR, en 42 (65.6%) se detectó sólo la banda de FeLV, y en el resto (34.4%), se detectó la banda de FeLV junto con la de endógenos. El 95.2% de los casos en que se detectó sólo la banda de FeLV eran también ELISA positivo, sin embargo, solamente el 36.4% de los casos de amplificación de las dos bandas eran también ELISA positivo (Figura 4). Existe una asociación estadística (P<0.05) entre la aparición única de la banda de FeLV y el resultado positivo a ELISA.

CONCORDANCIA ENTRE ELISA Y PCR: Se calculó el valor k, según la Tabla 2, con un nivel de confianza del 95%. El valor k puede tomar valores de -1 a 1, significando estos valores discordancia sistemática o concordancia perfecta, respectivamente. El Valor k entre ELISA y PCR para el diagnóstico de FeLV resultó de 0.69, con un intervalo de confianza de 0.55 a 0.84.

DISCUSIÓN

ESTUDIO SEROEPIDEMIOLÓGICO

A pesar de que para el cálculo de la prevalencia lo indicado es utilizar un método de muestreo probabilístico, creemos que, dada la cantidad de muestras analizadas, las prevalencias de FeLV en los distintos grupos de gatos en este estudio seroepidemiológico, reflejan bastante bien la cantidad de gatos infectados por este retrovirus en la población estudiada (gatos domésticos del área urbana de Madrid). 

La prevalencia de gatos FeLV positivos sanos (17.7%), coincide con los resultados de otros estudios. Por ejemplo, 18% en Italia (Bandecchi et al., 1992), 13.4% en Alemania (Fuchs et al., 1994). Existen otros estudios donde la prevalencia de gatos infectados fue mucho menor, por ejemplo, 2% de FeLV positivos en Sydney, Australia (Malik et al., 1997), o 1.2% de FeLV positivos en Noruega (Ueland & Lutz, 1992). Uno de los factores más importantes que causan estas diferencias es el estado de salud (gatos enfermos o sanos) de la población estudiada, que en algunos de estos estudios no queda bien definido. La diversidad de resultados también se puede deber a razones socio-culturales, que determinan el modo de vida y la procedencia de los gatos domésticos de cada país, condicionando la probabilidad de interacción entre gatos infectados y no infectados. 

De los resultados serológicos del grupo de gatos enfermos se concluye que estos animales tienen dos veces más probabilidad de estar infectados que los gatos asintomáticos, ya que la prevalencia de FeLV positivos (33.9%) se llega a doblar en este grupo. Aún así, la sintomatología es muy inespecífica, y un gran número de gatos con sintomatología asociada a estas infecciones son negativos. 

En el subgrupo de gatos "callejeros", la prevalencia de animales infectados (34.3%) es también mayor que en el grupo S (gatos asintomáticos). Los gatos recogidos de la calle, o que tienen libre acceso al exterior, presentan mucha mayor posibilidad de relacionarse con otros gatos infectados, por lo que es lógica la existencia de una mayor prevalencia de FeLV en este grupo. 

En el grupo de gatos sanos, la infección por el virus de la leucemia felina resultó más frecuente en animales jóvenes (el 70% de positivos tenía menos de 3 años). Durante esta fase de la vida, los gatos mantienen unas relaciones intraespecíficas más estrechas, lo que favorece la transmisión del virus. Las madres infectadas serían una fuente de transmisión importante, ya que el contagio a los cachorros se produciría con facilidad. En el grupo de gatos enfermos, aunque sigue siendo mayoría, la proporción de gatos infectados menores de tres años desciende sensiblemente (50.1%). Estas diferencias seguramente sean debidas al hecho de que generalmente, los gatitos infectados en edades tempranas, tardan varios años en desarrollar sintomatología (Hoover & Mullins, 1991).

En cuanto el sexo, en el grupo de animales sanos, la infección por FeLV fue más frecuente en machos. Sin embargo, en el grupo de animales enfermos, la proporción de machos infectados desciende significativamente. Este hecho sugiere que el sexo influya de alguna manera en el desarrollo de síntomas relacionados con estas infecciones. Otros investigadores (Hofmann-Lehmann et al., 1998), también detectaron diferencias entre machos y hembras infectados por otro retrovirus felino (FIV). Concretamente, se apunta a que el 17b-estradiol, inhibe la apoptosis en los linfocitos infectados. Si la apoptosis (muerte celular programada), que se considera un mecanismo de autoprotección de los linfocitos frente al desarrollo de la infección, se encuentra inhibida en las hembras por el 17b-estradiol, éstas presentarán una mayor tendencia a desarrollar sintomatología que los machos.

Los resultados serológicos obtenidos son acordes con los conocimientos epidemiológicos previos. Una considerable cantidad de gatos asintomáticos están infectados por FeLV, por lo que parece necesario realizar un diagnóstico rutinario sistemático en las clínicas veterinarias para el control de esta infección. Además, el grado de inespecificidad de los síntomas relacionados con FeLV hace imprescindible su inclusión en el diagnóstico diferencial en los casos de animales con síntomas relacionados. 
ANÁLISIS CLÍNICOS

La anemia aparece como una alteración asociada a los gatos infectados por FeLV. La anemia no regenerativa es un hallazgo clínico común en los gatos infectados por el virus de la leucemia felina (Norsworthy, 1993). En la mayoría de las ocasiones, la médula ósea presenta hipercelularidad, ya que la verdadera anemia aplásica es producida por FeLV-C, que es muy poco frecuente (menos de un 1% de los gatos infectados). La anemia no regenerativa puede ser el resultado de una enfermedad mieloproliferativa más que la manifestación de una enfermedad degenerativa. 

El 78% de los gatos FeLV positivos presentaban alteraciones en el número de leucocitos, siendo más frecuente la leucopenia que la leucocitosis. Esto puede explicar que la manifestación clínica más común de los gatos infectados por el virus de la leucemia felina sea el desarrollo de infecciones secundarias por causa de una inmunodeficiencia grave (Hardy & Essex, 1986). 

Algunos autores han señalado como causa de lesión renal (glomerulonefritis por depósito de inmunocomplejos) las infecciones por retrovirus felinos (Ishida et al., 1989; Poli et al., 1995; Malik et al., 1997). En este estudio, no encontramos en los gatos infectados por FeLV una mayor proporción de gatos con lesión renal que en los no infectados (asumiendo que los valores altos de urea y creatinina indican lesión renal). En cualquier caso, la única forma de confirmar la lesión renal es realizar un estudio histopatológico.

ESTUDIO COMPARATIVO ELISA-PCR

El 22.1% de las muestras que se analizaron por PCR, no mostraron ninguna banda de amplificación. Al no aparecer la banda de endógenos se asume que, como son secuencias presentes en el genoma de todos los gatos, no existía DNA en la muestra. Las causas más probables que pueden producir esta circunstancia son: estados leucopénicos (frecuentes en la leucemia e inmunodeficiencia), una inadecuada extracción de DNA, presencia de DNAsas, o fallos en la propia reacción de la polimerasa.

En cuanto a la comparación de resultados ELISA y PCR frente al diagnóstico de FeLV, la prevalencia de gatos a los que se les detectó genoma proviral de FeLV en el grupo de animales sanos (35.8%), es mucho mayor que la prevalencia de gatos ELISA positivo en dicho grupo (17.7%). Por otro lado, en el grupo de animales enfermos, ambas prevalencias son similares (35.7% y 33.9%). Como el desarrollo de sintomatología relacionada con FeLV está asociada a estados virémicos (Rojko & Kociba, 1991), es decir, ELISA positivo, el alto grado de discordancia en el grupo de animales sanos se debería a la detección por PCR de estados de FeLV latente que cursan sin sintomatología. Paradójicamente, y al contrario que ocurre con los resultados serológicos, la cantidad de gatos FeLV positivos por PCR es muy similar en el grupo de animales sanos (35.8%) y en el grupo de animales enfermos (35.7%). 

En términos globales, un 28.1% de las muestras en las que se detectó genoma proviral de FeLV, no presentaban antígeno viral p27 (PCR positivo/ELISA negativo). Como los falsos negativos en la detección de FeLV por la técnica ELISA son excepcionales (Barr, 1996), la mayoría de estos casos de discordancia se deberían a la existencia de un alto porcentaje de infecciones de FeLV, que al ser latentes y cursar sin viremia, no son detectadas por el método serológico clásico. A su vez, un 5.2% de los animales que fueron PCR negativo, presentaban antígeno de FeLV (ELISA positivo). Estos casos se pueden deber a infecciones tempranas en las que existe una viremia incipiente pero aún no ha habido integración del provirus en el genoma celular, o bien a infecciones en las que el gato presenta una respuesta inmune eficaz antes de que el virus alcance la médula ósea, originando una infección localizada. En este caso, si se realiza una PCR con DNA extraído del tejido en el que existe secuestro vírico, daría un resultado positivo. Tampoco se puede descartar en esta discordancia (PCR negativo/ELISA positivo), una falta de sensibilidad de la PCR (hecho poco probable por la detección conjunta de endógenos), o bien que estos casos se deban a falsos positivos de la técnica ELISA. 

Como se ha señalado anteriormente, por el propio diseño de la PCR, se dieron dos tipos de detección de FeLV. Bien aparecía exclusivamente una banda muy intensa a la altura de FeLV, o bien aparecían dos bandas correspondientes a FeLV y a las secuencias endógenas. La detección única de la banda intensa de FeLV tiene un alto grado de correlación (95.2% de los casos), con el estado virémico (ELISA positivo). A su vez, el 63.6% de los casos en los que se detectan FeLV y endógenos, son avirémicos (ELISA negativo). Durante el estado virémico el virus exacerba su multiplicación y expresión, por lo que existirá una mayor cantidad de linfocitos infectados. Al existir una mayor cantidad de DNA diana (provirus en linfocitos), los primers pueden presentar una mayor afinidad hacia la hibridación con secuencias de FeLV, agotando los reactivos para una amplificación conjunta de secuencias endógenas. 

La concordancia entre PCR y ELISA es media (0.69), siempre teniendo en cuenta que una técnica detecta el genoma proviral y otra un antígeno soluble del virus, con las diferencias que ello implica.

LA PCR COMO MÉTODO DIAGNÓSTICO DE FeLV

La reacción en cadena de la polimerasa aparece como un método diagnóstico eficaz y ventajoso para la detección de genoma proviral de FeLV. La principal ventaja de la PCR radica en su capacidad de detectar infecciones latentes, que al cursar sin expresión viral, no son detectadas por los métodos serológicos. Además de la evidente importancia epidemiológica del diagnóstico de estas infecciones, la importancia clínica de su detección radica en la posibilidad de reactivación en casos de inmunosupresión (Rojko et al., 1982; Rojko & Olsen, 1984), con las siguientes consecuencias: a) posibilidad de desarrollar enfermedades relacionadas con FeLV, b) contagio a otros gatos, c) transmisión de FeLV de madres infectadas a la descendencia. 

El alto grado de correlación entre la detección única de la banda de FeLV (sin que aparezca la banda de endógenos) y el resultado ELISA positivo (95.2%), confiere a la PCR además la posibilidad de diagnosticar viremia con un nivel de confianza científicamente aceptable. 


AGRADECIMIENTOS

Queremos agradecer la colaboración de todas las clíninicas veterinarias que han participado en este proyecto, en especial a D. Gustavo Sánchez y al personal del Laboratorio de Análisis Veterinarios (LAV). Agradecemos también la colaboración de la Dra. Elena Escolar del Departamento de Patología Animal II, y el asesoramiento epidemiológico del Dr. J. Antonio Ruiz-Santa-Quiteria, del Departamento de Patología Animal I, de la Facultad de Veterinaria (UCM).
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